Monitoreo ambiental, salud, sociedad y petróleo en Ecuador

Investigadores Principales: Laurence Maurice (GET) y Hélène Budzinski (EPOC)

Participantes : Eva Schreck (GET), Karyn Le Menarch, Marie-Hélène Devier, Patrick Pardon (EPOC), Gaëlle Uzu (LTHE) y ECOLAB laboratorios en Francia ; EPN, USFQ y EP Petroecuador en Ecuador

Colaboración Privada: LED Desarrollo de Ingeniería

Objectivos : Evaluación de los niveles de contaminación ambiental y la validación de instrumentos de monitoreo.

Entregables: Evaluación de la calidad ambiental (HAPs y metales pesados tóxicos) en las zonas estudiadas; Informes, artículos de rango A; biomarcadores específicos del impacto de las actividades petroleras en el área de estudio.

Métodos: Muestreo (instantáneo y pasivo), análisis químico básico, comparaciones con el fondo natural biogeoquímico, uso de marcadores biológicos (de defensa y daño), desarrollo de pruebas para medir la toxicidad de tejidos naturales

Riesgos: limitación de muestreo causada por el acceso al terreno y el número de análisis (limitaciones financieras o climáticas)

T3.1.  Estado actual del impacto ambiental causado por actividades petroleras (GET, EPOC, LTHE, EPN, USFQ) mediante muestreos activos y pasivos

El objetivo principal de la Tarea 3 del programa MONOIL es estudiar el impacto ambiental de las actividades petroleras a través del análisis y la aplicación de muestreos pasivos para medir hidrocarburos aromáticos policíclicos o HAPs, sus metabolitos y metales traza asociados a estas actividades (Ni, V, Cd, As, Pb y Hg en particular), en varios compartimentos: aire, agua (lluvia, aguas superficiales y subterráneas), sedimentos, suelos, cadenas alimentarias acuáticas y productos agrícolas. Este estado actual del impacto ambiental en relacion a las actividades petroleras se realizará en diversas matrices e interrelaciones que se establecerán para entender mejor: i) la transferencia de los HAPs, sus metabolitos y metales traza en el medio ambiente y ii) los riesgos potenciales que implica para los ecosistemas acuáticos y terrestres y la salud humana.

Nos proponemos analizar los HAPs / mezclas de metales pesados directamente vinculados a las actividades antropogénicas y cuyos riesgos en los ecosistemas y la salud humana se ha comprobado. Por un lado, estos compuestos no han sido analizados con precisión en esta región y, por otro lado, estas mezclas no se han analizado hasta ahora en los estudios de contaminación relacionada con el petróleo.

El muestreo del aire se realiza utilizando impactadores por inercia en puntos estratégicos, emisiones contaminantes directas y dentro de los poblados. Las partículas en aerosol se segregarán en base al tamaño gracias a material particulado (MP) dentro de filtros con el fin de determinar las características de la química en función de su granulometría. El MP emitido por las llamaradas se caracterizará por su tamaño (PM10, partículas con un diámetro < 10 micras, PM2.5, PM1). Para estas tres clases de tamaño, los niveles de partículas ambientales se llevarán a cabo mediante un analizador gravimétrico continuo (Dustrack, TSI). Metales y concentraciones de HAPs de las diferentes fracciones se analizarán en membranas de cuarzo después de 24 o 48 horas del impacto inercial, dependiendo de los niveles de MP.

Plantas epífitas como las angiospermas, líquenes o musgos se utilizarán también como bioindicadores de la contaminación del aire por metales/metaloides. Experimentos dependientes de tiempo se llevarán a cabo para seguir el curso de la transferencia del metal/metaloide y su proceso de acumulación en función de la especie vegetal, factores climáticos y el contexto de la contaminación.

Varias muestras (aerosoles, suelos y organismos) se conservarán para experimentaciones futuras en materia de impactos ecológicos y sanitarios utilizando biomarcadores y pruebas in vitro.

Para los compartimentos terrestres: muestras de suelos, plantas y organismos vivos se realizarán para determinar las concentraciones de HAPs y de metales/metaloides en las diferentes matrices. Suelos superficiales (0-30 cm) se recogerán en puntos estratégicos, cerca de las zonas de cultivo. Por otra parte, vegetales (raíces, brotes y partes comestibles) se cosecharán para determinar la concentración de metales/metaloides en sus tejidos. Algunos organismos terrestres (por ejemplo, invertebrados tales como lombrices de tierra que se sabe que tienen una alta tasa de acumulacion de metales pesados (Dai et al., 2004) y que metabolizan compuestos orgánicos (Schreck et al., 2008)) serán recogidos en suelos afectados a favor del monitoreo de la contaminación del suelo y de la comprensión de los procesos de bioacumulación en la cadena alimentaria. Las concentraciones de metales se determinarán en sus tejidos y se calcularán factores de bioacumulación y de enriquecimiento.

Como se ha detallado anteriormente para los ambientes terrestres, la integridad funcional de los ecosistemas (o su alteración) se evaluarán por medio de indicadores de ecotoxicidad basados en la descomposición de hojarasca. Para esto, se usarán las hojas de especies leñosas de ribera y serán  expuestas en los diferentes sitios de estudio en bolsas de basura sumergida.

En función de las posibilidades de obtener otras fuentes de financiamiento y / o involucrar a estudiantes de doctorado (PhD), estos indicadores basados en la descomposición de hojarasca pueden ser complementados con indicadores basados en la producción primaria acuática, como la colonización Perífita en sustratos artificiales (Biggs et al. 1988, MacDonald et al. 2012).

Para los compartimentos acuáticos: aguas lluvia, superficiales y subterráneas, así como organismos acuáticos, serán recogidos en las áreas afectadas. Especies acuáticas biológicas seleccionados para el muestreo deberán ser representativas de su entorno. Por ejemplo, los bivalvos, acumulan HAPs sin biomagnificación entre niveles tróficos, sin embargo, en los peces, no se acumulan sino que son enzimáticamente degradados (P450) y luego se excreta en la bilis en forma de metabolitos polares. Para evaluar la exposición de los organismos a HAPs y la contaminación en el medio natural en el contexto de la contaminación por hidrocarburos, también se analizarán los metabolitos de HAPs, especialmente en las especies de peces que son de consumo humano. También se planea combinar estos muestreos con la instalación de muestreadores pasivos que integran un flujo de HAPs disueltos (SPMD: dispositivo de membrana semipermeable) y metales pesados (DGT: Gradiente Difusivo de Película Delgada) en un periodo de tiempo seleccionado. Estos muestreadores se utilizan para medir las fracciones biodisponibles disueltas de estas moléculas tóxicas en áreas clave (lugares habitables, de pesca, de disponibilidad de agua potable, etc.).  Membranas pasivas serán colocadas en el agua y también en el aire, cerca de las zonas residenciales y de emisiones.

La determinación de las concentraciones de HAPs y de metales/metaloides se llevará a cabo en diferentes matrices. Los HAPs se extraerán usando el proceso de microondas y disolventes (acetona / hexano 1: 1) antes de ser analizados por Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas (GC-MS) de acuerdo con el protocolo desarrollado por Piñeiro - Iglesias et al. (2003). Los metales serán analizados por Espectrometría de Masas de Acoplamiento Inductivo de Plasma (ICP-MS) después de la digestión con ácido (HNO3/HF) y microondas de acuerdo con el protocolo desarrollado por Rimetz - Planchon (2007).
Para el diseño experimental, se han previsto veinte puntos de muestreo para cada sitio expuesto a la actividad petrolera (~ 40 muestreos por compartimiento: agua, suelo, sedimentos, peces / mariscos, productos agrícolas (raíces, brotes y partes comestibles) + 54 muestras de aire). Un control de  calidad del agua se llevará a cabo en las áreas aguas abajo de las zonas de explotación de petróleo: en la llanura inundable del Amazonas, a lo largo de los ríos Napo y Aguarico que limitan con Perú (~ 5 muestras por compartimento: agua, sedimentos, suelos y peces). Las muestras de agua, sedimentos y peces también se llevarán a cabo en un área de afloramientos naturales de piedra arenisca bituminosa (~ 10 muestras por compartimento: agua, sedimentos, suelo, peces / mariscos, los organismos del suelo y las plantas, si están disponibles) y también en una zona de control (~ 20 muestras por compartimento: agua, aire, suelos, sedimentos, peces / mariscos, los organismos del suelo y plantas). Para hacer frente a la variabilidad estacional de los flujos de contaminantes en el medio ambiente, al menos dos campañas de muestreo se llevarán a cabo, uno durante el período de aguas bajas y el otro durante las inundaciones, y si el aumento de fondos lo permite, una tercera campaña de validación durante el periodo de flujo bajo crítico.

Los resultados de la subdivisión de tareas serán útiles para la comprensión de los datos recogidos en las Tareas 1 y 5. Podemos destacar que la elección de especies centinela permiten integrar el papel de la dieta en las poblaciones humanas estudiadas. Por otra parte, es necesario el conocimiento de las concentraciones de contaminantes en los productos agrícolas que se consumen en las poblaciones humanas para llevar a cabo pruebas de bioaccesibilidad para evaluar la exposición humana y los riesgos involucrados.
Por último, se propondrá una evaluación global de los niveles y localización de la contaminación mediante cartografía y herramientas GIS con el fin de comprender de mejor manera el impacto sobre el medio ambiente y los riesgos para la salud humana. 

T3.2.  Selección, validación y optimización de las herramientas de monitoreo (GET, EcoLab, Ingeniería LED)

T

El segundo objetivo de la Tarea 3 es el estudio de los posibles impactos de las actividades petroleras en los ecosistemas y los seres humanos, y validar los diferentes ensayos de ecotoxicidad y biomarcadores en la Amazonía ecuatoriana para una transferencia a las autoridades competentes y a las universidades. Este trabajo tiene la intención de centrarse en varios biomarcadores y el uso de pruebas de bioaccesibilidad para humanos (para el proceso de ingestión y ensayos de oxidación para evaluaciones de inhalaciones).
Para los ecosistemas, además de pruebas de ecotoxicidad, los biomarcadores también se desarrollarán en paralelo con las medidas elementales de la contaminación química in situ. Un biomarcador es una respuesta biológica a una sustancia química sustancia presente en el medio ambiente que se puede conectar a una exposición o un efecto tóxico (Peakall, 1994).

En los suelos, la fitodisponibilidad contaminante se determinará con extracciones de suelo utilizando diferentes sales y / o quelantes. Las extracciones de metales/metaloides del suelo mediante CaCl2 o EDTA se realizarán por la forma descrita por Chaignon et al, 2003.; Feng et al, 2005.; Schreck et al., 2012.

Ensayos de germinación de semillas y crecimiento se realizarán en plantas seleccionadas ampliamente cultivadas en Ecuador en las diferentes áreas afectadas (Theobroma cacao, Viscia faba, Manihot esculenta).

Algunos biomarcadores relacionados con las actividades fotosintéticas también serán desarrollados para evaluar los efectos tóxicos de los HAPs y metales en las plantas terrestres. Para esta finalidad, los contenidos de pigmentos fotosintéticos se determinarán utilizando métodos espectrofotométricos y / o HPLC. Una posible alteración de la conversión fotoquímica en las hojas de las plantas se evaluará a través de Métodos de Fluorescencia de Clorofila Modulados mediante Pulsos (Maxwell y Johnson 2000). Estos métodos permiten la estimación de las tasas fotosintéticas a partir de cambios en el fotosistema II estimulados por luz, y se pueden usar para estimar la captura de fotones por los pigmentos captadores de luz, las reacciones de luz, la tasa de transporte de electrones en el tilacoide (ETR), y algunos sistemas regulatorios de retroalimentacion asociados. Pueden ser utilizados tanto para proporcionar marcadores genéricos de estrés en plantas, y para entender los mecanismos de inhibición de la fotosíntesis.

Por último, los micronúcleos se utilizarán como biomarcadores de anomalías de ADN nuclear y de inestabilidad cromosómica. De hecho, los ensayos estandarizados de micronúcleos (MN) son ampliamente utilizados para evaluar la genotoxicidad de contaminantes en varios tipos de células y para evaluar el grado de pérdida de cromosomas (efecto aneugénico) o rotura (efecto clastogénico) (Shahid et al. 2011).
Seguidamente a la exposición al metal/metaloide, la composición de ácidos grasos de las hojas de la planta se modifica después de la exposición a suelos contaminados por metales (Le Guédard et al., 2008). Una proporción de ácidos grasos foliar estandarizada (C18: 3 / (C18: 2 + C18: 1 + C18: 0)) está disponible hoy en dia para diagnosticar la contaminación del suelo por metales ex situ (AFNOR, 2012) y fue utilizado con éxito en el campo (Le Guédard et al., 2012 a, b). Tanto las vías foliares y radiculares tiene un impacto significativo en la composición de ácidos grasos en las hojas de las plantas y no interactúan entre sí. Recientemente, una nueva cantidad adimensional representa el producto ponderado de los coeficientes de concentración de ácidos grasos: Z = (C16: 1/C16: 0) (C18: 3/C18: 0) 0,57 (C18: 1/C18: 2) 0.23, y se ha construido a partir de los análisis estadísticos. Este índice proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos implicados en la absorción de metales (vías aéreas o del suelo) y fitotoxicidad (Schreck et al., 2012). La composición de ácidos grasos en las hojas de la planta representa un enfoque sólido y fructífero para detectar y comprender los efectos de la contaminación por metales en las plantas. Una disminución en la cantidad de ácidos grasos tri-insaturados en plantas superiores también se observó para las plántulas de tomate cultivadas en un medio de cultivo que contiene cobre o cadmio (Ouariti et al, 1997;  Djebali et al, 2005), así como para plántulas de pimienta cultivadas en solución nutritiva suplementada con Cd (Jemal et al, 2000; Ben Youssef et al, 2005). Entonces, la relación de ácidos grasos foliar se determinará en varias especies de plantas expuestas a los contaminantes in situ. Los experimentos y las medidas se llevarán a cabo en colaboración con los laboratorios de LBM y LEB en Bordeaux.

En cuanto al impacto de la contaminación sobre los microorganismos, se utilizará la prueba en fase sólida Microtox ® para evaluar la toxicidad de los suelos o sedimentos contaminados (Doshi et al, 2008; Barrena et al, 2009; Schreck et al, 2011). Dicho examen mide la disminución de la luz emitida por la bacteria bioluminiscente Vibrio fischeri cuando es expuesta a contaminantes. La toxicidad se reporta como EC50 en concentraciones efectivas, en las cuales la concentración de un contaminante produce un 50% de reducción en la emisión de luz.

Para tener una idea de los impactos ambientales a nivel de HAPs y metales asociados, algunos marcadores de ecotoxicidad se utilizarán, así, con un enfoque particular en la descomposición de hojarasca como un indicador de la integridad de un ecosistema funcional (Gessner y Chauvet 2002, CORNUT et al. 2012). Este proceso depende tanto de las características de la hojarasca, de parámetros externos abióticos y de la presencia, abundancia y actividad de microorganismos y macroinvertebrados. Esto ha sido bien documentado para especies leñosas y plantas herbáceas, bajo diferentes climas incluyendo los tropicales, tanto en hábitats acuáticos (por ejemplo, Costantini et al. 2004, Konig et al. 2014) y terrestres (por ejemplo, Walter et al. 2013; Meyer et al. 2013). La tasa de descomposición de la hojarasca en particular, ha demostrado ser un indicador sensible de la contaminación por metales (Kohler et al 1995, Roussel et al 2008; Lecerf y Chauvet 2008). Algunas bolsas de basura serán desplegadas en los sitios de estudio (usando desechos de especies de plantas nativas comunes leñosas y / o herbáceas), y las tasas de descomposición serán comparadas entre los lugares contaminados y de referencia o control. Si es necesario, se llevará a cabo una corrección de temperatura para permitir dichas comparaciones. Estos datos estarán relacionados con la biomasa de macroinvertabrados y hongos dentro de las bolsas de basura. Dependiendo de la posibilidad de conseguir fondos adicionales, se puede realizar una evaluación de la biomasa de diferentes grupos microbianos (incluyendo bacterias y hongos) mediante la técnica de qPCR.

Los biomarcadores tales como metalotioneínas en los organismos terrestres también se desarrollarán en paralelo con las medidas básicas de la contaminación por metales in situ. En realidad, las metalotioneínas pertenecen a un grupo de proteínas intracelulares, complejas y ricas en cisteína cuyo contenido en un organismo aumenta mientras aumenta la concentración de metales pesados. Entonces, su uso podría ser útil para determinar el impacto global sobre los ecosistemas del suelo (Huska et al, 2008; Schreck et al, 2008.).
La actividad de la colinesterasa (ChE) se estudia como un biomarcador de exposición a contaminantes (Denoyelle et al., 2007; Reinecke y Reinecke, 2007a; Reinecke y Reinecke, 2007b). La acetilcolinesterasa permite la hidrólisis del neurotransmisor acetilcolina durante las sinapsis. Algunas moléculas tóxicas inhiben esta enzima y son responsables de una sobre-acumulación de acetilcolina que causa el tétanos y la muerte (Day y Scott, 1990; Stenersen et al., 1992; Jemec et al., 2007; Reinecke y Reinecke, 2007a; Reinecke y Reinecke, 2007b).

Además, se piensa muy frecuentemente que la exposición a compuestos orgánicos tales como los HAPs inicia un proceso de metabolización (Saint-Denis et al., 1998). En eucariotas, por lo general se produce en dos fases, de las cuales la segunda implica enzimas de conjugación, tales como glutatión -S - transferasa (GST) que unen un compuesto polar a las moléculas tóxicas, promoviendo su eliminación por excreción. Por lo tanto, el aumento de la actividad de GST será evaluado para cuantificar el proceso de metabolización inducida por la exposición a contaminantes. Por último, la fase de metabolización puede implicar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), cuyos efectos son contrarrestados en los organismos mediante enzimas antioxidantes (Saint- Denis et al., 1998). Una de ellas es la catalasa (CAT), la cual es responsable de descomponer los radicales libres de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en agua y oxígeno molecular, sobre todo en el caso de la exposición a los HAPs (Brown et al., 2004). Así, un aumento de su actividad debe indicar indirectamente el metabolismo de los contaminantes que conducen a la desintoxicación del suelo.

En la atmósfera, se caracterizarán los factores de emisión centrales (CO/CO2, Carbon Negro / Carbono Orgánico, metales, HAPs). Las propiedades redox del MP se han considerado como un factor unificante para explicar la actividad biológica de los contaminantes del aire ambiente por lo tanto, se caracterizará el potencial pro-oxidante de estos aerosoles. Se evaluará mediante la capacidad intrínseca de un aerosol para oxidar el medio ambiente y podría ser utilizado como un indicador predictivo de la contaminación/salud por su agresión en los pulmones (Cho et al, 2005; Uzu et al, 2011). La evaluación del potencial pro - oxidante de aerosoles se hará mediante la prueba de DTT acelular la cual se correlaciona directamente con las respuestas inflamatorias biológicas, según lo informado por Cho et al. 2005; Li et al. 2003; Uzu et al., 2011 trabajando en áreas urbanas de contaminación alta. Este diagnóstico se hará en la escala del área de estudio, Dayuma y Pakayaku correspondientes a las subcuencas de los ríos Tiputini y Aguarico y luego serán comparadas con la zona de control; se estimarán los factores de enriquecimiento de acuerdo con el fondo geoquímico medido en una cuenca prístina.
Para los compartimentos acuáticos, se estudiarán dos biomarcadores no celulares: (1) Los metabolitos de los HAPs están involucrados en el daño del ADN y los efectos cancerígenos asociados con los HAPs. Se producen en la bilis de los peces y se pueden medir gracias a sus propiedades fluorescentes. Estos biomarcadores también ofrecen información sobre la biodisponibilidad de los HAPs en las especies de peces estudiadas. (2) Tumores hepáticos: un examen histopatológico del hígado de peces recolectados se llevará a cabo con el fin de revelar la presencia de tumores micro y macroscópicos. Estos análisis y marcadores se llevarán a cabo en diferentes tipos de matrices.

(1) Mediante muestreadores pasivos capaces de acumular contaminantes presentes en el agua, como HAPs (SPMD) y metales traza (DGT): En el agua, los muestreadores pasivos como SPMD (membrana semipermeable) o DGT (gradiente difusivo de película delgada) simularán la bioconcentración de HAPs disueltos y metales pesados en especies animales. El SPMD simula la bioconcentración, en organismos acuáticos, de contaminantes orgánicos en los tejidos (ácidos grasos) y concentran las formas disueltas de HAPs, hidrocarburos alifáticos, PCBs, dioxinas, furanos y pesticidas clorados. La técnica de DGT es dinámica y concentra la fracción disponible (lábil) de metales pesados (Hg - total y metilmercurio -, Pb, As, Cd, etc) que se encuentran disueltos en el  agua. Estos muestreadores se utilizan comúnmente para medir la presencia de contaminantes en las aguas dulces y marinas.

(2) Especies Animales Centinela: Estas especies serán seleccionadas de acuerdo a criterios estándar asociados a especies centinela: sedentarismo, fácil identificación y captura, tamaño de la población, áreas de distribución amplia y referenciada (áreas afectadas y no afectadas), longevidad de varios años, la disponibilidad de datos bibliográficos para biomarcadores clásicos. Diferentes órganos serán recogidos de acuerdo a su nivel de acumulación o de metabolismo: hepatopáncreas y hepatocitos en los moluscos, la bilis, el hígado, la sangre, el cerebro y los músculos de los peces.
Como se ha mencionado para las plantas terrestres, los biomarcadores moleculares, como el ensayo de micronúcleos (MN) también serán aplicados en los eritrocitos de peces. Un aumento en la frecuencia de MN se ha demostrado como resultado de la exposición a diversos compuestos que se encuentran en el medio acuático, como HAPs (Al- Sabti y Metcalfe, 1995; Pacheco y Santos, 1997), metales pesados (Al- Sabti y Metcalfe, 1995) y pesticidas (Polard et al 2011). La inducción de MN indica mutagenicidad no reparable y por lo tanto este biomarcador temprano es ampliamente utilizado en los peces para investigar los efectos genotóxicos de los productos químicos, aislados o en mezclas, presentes en el medio ambiente acuático.

Una vez asimilados por un organismo, los compuestos xenobióticos incluyendo HAPs sufren una serie de procesos de biotransformación, antes de ser excretado a través de la bilis en forma de metabolitos hidroxilados y / o conjugados. Por lo tanto, tal como se presenta anteriormente, los  metabolitos biliares de estos contaminantes se utilizarán en este estudio como marcadores de exposición en los peces. Además, la activación de los sistemas enzimáticos de biotransformación (sistema del citocromo P450 medido a traves de la actividad de la 7 - etoxiresorufina - O - deetilasa EROD) puede servir como una herramienta ecotoxicológica para evaluar la respuesta del organismo a estos contaminantes.
En este proyecto, sería de interés el estudio de las relaciones entre la actividad de EROD en el hígado, el nivel de micronúcleos en células de sangre y la concentración de metabolitos de HAPs en la bilis de los organismos centinela, como los peces.
La activación de los mecanismos de desintoxicación lleva a retos energéticos significativos a los peces intoxicados. Se ha demostrado evidencia en cuanto a estos costes energéticos reflejados en disminuciones en las tasas de crecimiento, actividad y éxito reproductivo reducidos de los peces expuestos a contaminantes (Smolders et al, 2003;. Nault et al 2013). Para evaluar dicho impacto de los contaminantes sobre el presupuesto energético de los organismos expuestos, se desarrollará un ensayo de Asignación de la Energía Celular Bioquímica (CEA; De Coen y Janssen, 2003) en el hígado, músculo y gónadas de peces centinela.

Los biomarcadores de efecto se estudiarán también para evaluar el impacto de la contaminación sobre la salud humana. Estos biomarcadores de efecto miden el deterioro de las funciones celulares vitales tales como la fragilidad de los lisosomas de membrana (NRRT) y daños en el ADN (LUCS). La  Prueba de LUCS (Fernández Cruz et al. 2002) es un enfoque simple, robusto e informativo en el cual se mide a partir de células humanas vivas, los efectos que tienen los contaminantes sobre la integridad estructural del ADN. Se puede implementar para la evaluación de la toxicidad genérica y / o el estrés oxidativo generado por el contaminante (Fernández - Cruz et al., 2012). Esta prueba se ha seleccionado como una prueba de toxicidad de referencia en varios programas de investigación (ANR Sécuriviande y RIMNES) y por la AFNOR (validación en curso). El ensayo de micronúcleos también se llevará a cabo en muestras de sangre humana.
La Bioaccesibilidad del contaminante por ingestión o inhalación es actualmente investigada en términos de evaluación de riesgos en diversas matrices. Una gran cantidad de pruebas ex vivo se han desarrollado en los últimos años con el fin de determinar por medio de experimentos de laboratorio la fracción biodisponible de metales para los organismos.
Asimilados por las plantas a través de la raíz o de las plántulas, los metales pueden entrar en la cadena trófica en cantidades significativas (Alexander et al, 2006; Polichetti et al, 2009; Perrone et al, 2010) y podría ser responsable de los riesgos de contaminación y toxicidad humana a través del consumo de alimentos. Entonces, con el fin de evaluar el riesgo de contaminación humana por la ingesta de productos contaminados, se llevarán a cabo ensayos de bioaccesibilidad en muestras de  vegetales. La prueba ex vivo (BARGE) permite estudiar la bioaccesibilidad humana de los contaminantes primarios en los suelos y vegetales como el arsénico, el plomo y el cadmio, mediante la simulación de las condiciones fisicoquímicas del tracto gastrointestinal humano (Caboche et al., 2009).
Por último, las interrelaciones entre (1) el nivel de contaminación por HAPs, metabolitos de HAPs y metales traza de los medios ambientales (aire, suelo, agua), (2) el nivel de contaminación del medio biológico (plantas, la fauna del suelo, organismos acuáticos), y (3) el nivel de estrés en los medios biológicos medidos a través de biomarcadores se resaltará con los análisis estadísticos apropiados. Los resultados estadísticos traerán materiales adicionales con el fin de evaluar la fuerza de las relaciones entre el nivel de contaminación del medio ambiente, el nivel de contaminación de los medios biológicos, y el estrés biológico. Los resultados estadísticos también ayudarán en la comparación de la eficiencia de todos los biomarcadores y ofrecerán una selección de los biomarcadores más relevantes y no redundantes. Más detalladamente, las interrelaciones entre los niveles de contaminación y estrés de los medios biológicos serán destacadas por el estudio de las correlaciones entre los dos conjuntos de variables con PCoA (Análisis Principal Coordinado) y RDA (Análisis de redundancia). Ambos conjuntos de variables se medirán en el mismo conjunto de muestras, una muestra siendo de un organismo. Las interrelaciones entre el nivel de contaminación del medio ambiente y el estrés biológico también serán destacados por el estudio de las correlaciones entre los dos conjuntos de variables con PCA y RDA. Esta vez, el análisis se realizará en un nivel superior, una muestra siendo de una localidad, ambos conjuntos de variables se medirán en las mismas localidades. Las interrelaciones significativas resaltadas para ambas series de análisis estadísticos ayudarán a un mejor entendimiento de i) la transferencia de los contaminantes del ambiente hacia las matrices biológicas y ii) los riesgos potenciales involucrados para los ecosistemas acuáticos y terrestres.

Repartición del trabajo entre los equipos franceses